普通会员

天津世鼎门窗安装工程有限公司

民航、会展中心、厂房等

小鱼儿开奖网一肖中特
中枢神经系统细胞分离方法的研究进展

来源:本站原创  作者:admin  更新时间:2021-07-19  浏览次数:

  对中枢神经系统的各类细胞进行单独分离,是研究不同细胞群对正常和异常中枢神经系统发育、衰老和病理方面影响的基础。目前,有很多分离细胞的技术,例如磁性细胞分选法(magnetic cellsorting,MCS)、激光显微解剖术(laser-capturemicrodissection,LCM)、微流控技术等,本文总结目前已应用于中枢神经系统细胞分离的各类方法及其各自特点,方便研究者选择。

  中枢神经系统细胞由神经细胞和胶质细胞组成,其中神经细胞主管信息传导,胶质细胞为神经元的活动提供营养、支持、免疫等作用。神经胶质细胞包括少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞3类,不同的细胞具有不同的生理功能。

  星形胶质细胞是最大的神经胶质细胞,胞体为球形并有许多长突起,包绕血管周围形成一层胶质膜,是构成血-脑屏障的一部分,同时为其他细胞提供营养支持;少突胶质细胞数量最多,其突起少而短,包绕神经细胞轴突形成髓鞘,支持神经纤维的信号传递;小胶质细胞数量不多,体积较小,来源为单个核细胞,为中枢神经系统提供免疫作用。这些细胞之间相互联系、作用复杂,其细胞异质性给相关功能研究带来很大困难。

  细胞在增殖分裂过程中所表现出来的特性是不同的,通过这些差异可在细胞体外培养过程中对其进行分离。利用细胞贴壁时间不同,MCCARTHY 和DE VELLIS最早提出培养分离星形细胞和少突胶质细胞的方法,其将小鼠的脑组织制成细胞悬液并进行混合培养,神经元在后期培养时因培养基血清中谷氨酸等成分而死亡,而星形细胞位于培养基底层,其余胶质细胞位于上层,然后利用蛋白酶、摇床等物理方法可以使表层细胞分离。

  这种物理分离简单快捷,但是在分离过程中可能会伴有其他种类的细胞脱落影响纯度,针对此有学者提出相应的改良方案,比如应用被抗体覆盖的培养板使细胞与培养皿之间贴合更加紧密,减少其在震荡中的脱落,以及利用利多卡因处理培养基使小胶质细胞悬浮并分离等。而在培养过程中,细胞的一些性质会发生变化,如形态、基因表达等,可能会对细胞质量产生影响,在选择方法时应注意这一点。

  目前,最常用的密度梯度离心液有Percoll、蔗糖溶液等。Percoll分离液由包裹聚乙烯吡咯烷酮的硅胶构成,具有无毒、等渗、低黏度、易制备、易去除等优点,被广泛应用在细胞、细胞器、病毒及其他亚细胞颗粒的分离应用中。其原理为当颗粒悬浮液离心后,沉降速度和离心力、溶液物理性质是成比例的;在一个固定的离心力和液体黏度(μ)下,颗粒沉降速度(v)与颗粒直径(d)及其自身密度(ρp)和周围介质的密度(ρl)差相关:v = d2(ρp-ρl)× g/18μ。

  利用Percoll 分离液进行分离有连续梯度和非连续梯度两种方案。连续梯度要首先通过超速离心机对分离液进行离心处理,使其形成从管顶部到底部的密度平滑变化,分离后并不会形成明显的细胞分层界面。非连续密度梯度提供极大的灵活性和易用性,只需要制备出可以将细胞密度包含在内的两个密度溶液,低速离心即可完成分离,这也是目前细胞分离纯化常用的方法。而使用非连续密度梯度离心所分离出来的小胶质细胞纯度,已证明可达到80%左右。利用Percoll 进行细胞分离比较简便,但其分离所依赖的细胞生物力学特性单一、纯度较低,通常作为初次提纯方法应用于其他分离方法之前。

  LCM是指通过使用激光切割目标细胞所在的微小区域,从而得到目标细胞群体的技术。在已经被固定组织中,可直接切割剥离目标区域;而对活的细胞需要进行特异性染色示踪,利用特殊的收集板捕捉,再切割收集细胞周围区域。在中枢神经系统中,LCM可以对病变组织进行针对性提取,为分析神经元特异性表达基因提供帮助,目前已经成功对阿尔茨海默病海马组织、胶质瘤组织等相关致病基因进行分析。

  同时,LCM也可以作为分离胚胎脑组织中神经干细胞的手段,能够在保证细胞活性的基础上获得干细胞并进行培养。这项技术的优势在于能够准确和定量收集目标细胞,利于下游的细胞培养以及细胞分子定量测定,但其需要依靠人工寻找目标细胞,产出量较低,需要较为专业的器械,这些限制其应用。

  利用针对细胞类型特异性表面抗原的磁性标记抗体来分离细胞群是一项已有近30 年历史的技术,目前使用较为广泛。其通过将磁珠与抗体结合,再与细胞表面的抗原形成免疫复合物,然后使用带有相反电荷的分选磁柱吸引这些标记细胞,达到分离效果。被分选细胞为目标细胞称为阳性分离,反之称为阴性分离。

  在中枢神经系统细胞,该技术可以成功分离神经元细胞及各类胶质细胞,同时实现分类定制化,这对分选非同类细胞以及处于不同发育阶段的同类细胞有重要意义。除了其实用性,这项分选技术相比于流式细胞术更加温和,比LCM技术产量更高,允许细胞过程的保留和膜蛋白分析,甚至可以进行分离培养。

  微流控技术(microfluidics)指的是能够在微米级别乃至更精细结构中对流体进行精准控制的技术,兴起于20世纪90年代,并在后来的不断发展中逐渐渗透到各个领域,尤其在当前注重“精准医疗”的医学领域,微流控芯片以其低成本、www.94876.com,高精度、高通量、自动化等优点,很快成为研究热点。

  微流控在细胞分离方面有抗体依赖和非抗体依赖两种:非抗体依赖常用到的方法有过滤、声波分选、介电泳分选等,通常利用细胞尺寸大小、变形能力、所带电场的区别,可以在短时间内分离拥有特殊物理学特性的细胞,其具有成本低、易操作等优点;抗体依赖则是通过将特异抗体固定在流体芯片通道内,使目标细胞的表面抗原与之形成免疫复合物,从而将细胞分选出来,这样做可以使分选更加准确,但也增加成本。

  还有研究者将微流控与MCS相结合,通过使用免疫磁珠收集固定目标细胞,在流经微流体通道时外加直流电场,被特异性标记的细胞就会因为电场力的作用进入特定通道或被带相反电荷的磁珠捕获,从而达到分离。

  相对于单纯使用磁珠分离细胞而言,在微流控通道中应用MCS 分离细胞的速度较慢,但由于其在流动过程中每一个细胞均有机会与带磁进行充分接触,因此,更适合进行小样本处理。与此同时,在微流控通道内可以同时评估细胞的形态学特性、物理特性,可以使捕获细胞的种类更加明确。

  流式细胞术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)作为微流控技术应用于生物医学领域派生出的技术代表,其通过采集流经通道的单个细胞光电信息,对细胞进行识别、分选。与MCS 类似,可以针对细胞内或细胞膜上特异性靶点制作携带荧光抗体,荧光修饰的细胞会被流式细胞仪识别,广东鹰坛高手心水主论坛!并能通过门控通道将被标记的细胞进行富集,已被证明可以准确识别并分离各类胶质细胞,对下游的DNA、RNA、蛋白质研究提供便利。

  以上所述各种细胞分离方法均能分离中枢神经系统细胞,因分离原理不同而各具有优缺点。选择细胞分离方法主要由研究目的、技术条件、成本等所决定。如果是进行一般的细胞生化、药理实验,对细胞生理状态无特定要求,使用培养分离的方法即可获得大量的细胞样本,难度和成本低;如果是针对细胞形态、生理方面实验,例如胶质瘤细胞侵袭性研究,需要尽量保持细胞处于正常生理状态,则需要LCM、MCS这样高精度、高成本的技术。密度梯度离心分离由于纯度较低,常用于其他实验步骤之前来去除细胞溶液中红细胞等杂质。

  MCS和FACS是目前应用最为广泛的细胞分离技术,无论是同种或不同种类型的细胞,只要存在免疫特异性,即可进行准确分离,而过高的成本也限制其应用。微流控技术的发展,逐渐显示出其在细胞培养、识别、分离中的优势,其载体微流控芯片作为成本低廉、组合容错性极佳的平台,可以集成众多单元于一体。液体流动带动细胞流动的过程中可以作为参考的项目更多,比如细胞尺寸、顺应性、免疫学、电学及光学性质等,同时也可以与其他分离方法相结合,比如免疫磁珠,使细胞捕获过程更加准确,这将是未来在细胞分离方面的重要发展方向。

  来源:耿新,任翔,王春红,成睿,吉宏明.中枢神经系统细胞分离方法的研究进展[J].中国微侵袭神经外科杂志,2021,26(03):137-140.